Restriktionsenzymer är enzymer som skär både enkelt- och dubbelsträngat DNA. Varje restriktionsenzym har en specifik nukleotidsekvens, som kallas en restriktionsplats, som den känner igen och skär. Restriktionsenzymer används för DNA-sekvensering, mutationsanalys och kloning och amplifiering av DNA. Forskare använder restriktionsenzymer för att införa gener av intresse i expressionsvektorer, DNA-molekyler som kan replikera separat från kromosomalt DNA. Vektorn som innehåller genen av intresse kan sedan införas i en bakteriell stam för expression och karakterisering av proteiner.
Dagens video
Steg 1
Identifiera restriktionsenzymwebbplatser på din vektor genom att titta på en restriktionskarta. Begränsningskartan kommer att berätta vilka enzymer som kommer att skära din vektor och var.
Steg 2
Välj ett restriktionsenzym som också har en sida närvarande på din geninsats, genom att titta på sekvensen av insatsen. Se till att restriktionsstället är i en position på din insats som ligger utanför genen av intresse så att du inte förlorar någon del av genen.
Steg 3
Kontrollera att det inte finns några duplikat av restriktionsstället någonstans i din geninsats eller vektor. Detta kommer att orsaka flera nedskärningar i ditt DNA och ge dig vilseledande data.
Steg 4
Försök att välja restriktionsenzymer som skär med klibbiga ändar, snarare än trubbiga ändar. Klibbiga ändar uppstår när enzymet skär dubbelsträngat DNA på ett förskjutet sätt, vilket lämnar ett enkelsträngat överhäng som underlättar fastsättning med en insatsskärning på motsatt sätt. Stumma ändar uppträder när dubbelsträngat DNA skärs på ett jämnt sätt, och dessa är svårare att fästa.
Steg 5
Välj ett annat restriktionsenzym för båda ändarna av din insats för att säkerställa att det sätts in i vektorn i rätt orientering och för att säkerställa att vektorn inte fäster på sig igen.
Steg 6
Försök välja två restriktionsenzymer som fungerar bra i samma buffersystem och temperatur. Om detta inte är möjligt, springa varje uppslutning separat.
Saker du behöver
- Sekvens för geninsats
- Begränsningskarta för valfri vektor
- Lista över restriktionsenzymer och deras skurna webbplatser
Tips
- Vissa webbprogram har utvecklats för att identifiera restriktionsställen på en DNA-sekvens snabbt. Ett sådant program är från New England BioLabs.
